· polyakrylamidgelový mošt z akrylamidového monomeru, výchozího polymeračního materiálu, katalyzátoru a směsi soli a pufru dohromady.
· akrylamida BIS (N,N'-methylen dvojitý akrylamid) je monomerní forma gelové matrice.
· persíran amonný zahajuje proces polymerace lepidla.Formulace lepidla vyžaduje 10% roztok persíranu amonného připravený ve vodě.Většina informací naznačovala potřebu aktivního používání.Nicméně 10% roztok může být umístěn při 4 °C po dobu několika týdnů bez významné ztráty aktivity.Doplňte do 10 ml a zlikvidujte, když lepidlo neagreguje.
Tip: Procentoakrylamidv sekvenačním lepidle a proteinovém lepidle není totéž.Pokud používáte předem připravený roztok akrylamidu: BIS, ujistěte se, že máte správnou láhev.
· TEMED (N,N,N',N'-tetramethylethylendiamin) je katalyzátor v hnědé lahvičce umístěný v chladničce.Přidejte těsně před nalitím lepidla.
· Polyakrylamidová elektroforéza použité sklo při elektroforéze by se mělo před každým i po něm umýt.Po elektroforéze omyjte měkkým kartáčem a hadříkem v horké mýdlové vodě, opláchněte destilovanou vodou a nechte uschnout.
· Dutý polymer může způsobit vlhkost a prach.Před elektroforézou očistěte skleněnou desku čističem na sklo a otřete ji měkkým kartáčkem.Omyjte destilovanou vodou a důkladně osušte papírovou utěrkou.Oplach 70% etanolem před setřením papírem pomáhá k čištění a urychlení schnutí.Postupně přidejte vzorky akrylamidu: BIS, voda, tlumivý roztok, persíran amonný, TEMED.Dobře protřepejte a ihned nalijte.
Před polymerací není nutné polyakrylamid odplyňovat.(Akrylamid býval umístěn do vakua, aby se odstranily bubliny, protože kyslík inhibuje polymeraci.)
Vzorové hroty vodorovných lepených bodů.
· do spodní krabice vložte kousek černého papíru s černým pozadím, abyste vytvořili vzorový otvor, abyste viděli jasněji.
· pufr naplněný lepidlem těsně nad koloidem.
· pokud má okraj světlo, zapněte světla, nechte světlo svítit koloidně.Natáhněte vzorek do pipety.
· pomocí automatického pipetovacího zařízení.
· v 10-200 μl kapaliny lze použít pohyblivý bod ve většině bodů na vzorku.Pro velmi malé otvory pro vzorky (méně než 10μ1) je vhodnější dlouhá pipetovací hlava používaná pro sekvenování lepidla.
· pipetování právě ponořené do vzorku, vdechování pomalu se pohybující tekutiny.Vzorek se může zdát lepkavý glycerinem a rychlé čerpání může nasát vzduchové bubliny do hlavy pipety.
· vzorky po vdechnutí pipetovací hlavice budou jemně pohybovat tekutinovou hlavicí na okraji trubky nebo utírací papír nasaje hlavici tekutiny mimo kapičky.Dávejte pozor, abyste vzorek nenasáli.
Umístěte vzorek do otvoru pro vzorek
· pipetovací zařízení pro udržení malého tlaku, aby se vzorky mírně pohybovaly přepadovou kapalinovou hlavou.
· pipetovací hlavice zasunutá do pufru, mírně výše než bodové otvory, udržuje pozitivní tlak.Špičku pipety lze zasunout do malého otvoru.
· pomalu a plynule odebírejte vzorky.Špička pipety se umístí nad otvor pro bodový vzorek a vzorek se ponoří do otvoru.Nechte vzorek klesnout, aby se zaplnil otvor pro vzorek, místo toho, abyste jej zasunuli dovnitř.
· po poslední kapce vzorku s kapalinovou hlavou se kapalina přesune do druhé větve, pomalu zvedněte kapalinu, vysuňte se z pufru
Jak provést vertikální vzorkování lepidla?
· svislé otvory pro vzorky lepidla vytvořené mezi dvěma kusy skla.U velmi tenkého lepidla nelze hlavu pipety vložit ani mezi dvě skleněné destičky.Pozor na glycerin!Umístěte hlavu pipety nad otvor pro vzorek a vzorek se ponoří do otvoru.
· bodový vzorek předtím, ujistěte se, že vertikální bod polypropylenového acylového gelu je otvor vzorku opláchnut dočista.Smyjte nezpolymerovaný akrylamid a vodu, která se může objevit na dně otvoru pro vzorek.Voda může vzorkovací otvor výrazně zmenšit.Použijte 25ml nebo 50ml injekční stříkačku a 18gauge jehlu.Nalijte elektroforetický pufr a opatrně propláchněte otvor pro vzorek.
· může být obtížné vidět otvor vzorku, ale zároveň je zbytek snadný.Pokud jsou otvory přebytečné, může být vzorkový pufr testován bromfenolovou modří.
Čas odeslání: 31. března 2023