· polyakrylamidGel musí být vytvořen akrylamidovým monomerem, výchozím materiálem pro polymeraci, katalyzátorem a správnou směsí soli a pufru.
· akrylamida BIS (N,N'-methylenový dvojitý akrylamid) je monomer ve formě gelové matrice.
· persíran amonný zahájí proces polymerace lepidla. Pro složení lepidla je vyžadován 10% roztok persíranu amonného připravený ve vodě. Většina informací uváděla nutnost aktivního použití. 10% roztok však lze umístit při teplotě 4 °C po dobu několika týdnů bez významné ztráty aktivity. Doplňte do 10 ml a zlikvidujte, když lepidlo přestane agregovat.
Tip: ProcentoakrylamidV sekvenování není lepidlo a proteinové lepidlo totéž. Pokud používáte předem připravený roztok akrylamidu:BIS, ujistěte se, že máte správnou lahvičku.
· TEMED (N, N, N ', N '- tetramethylethylendiamin) je katalyzátor v hnědé lahvičce, umístěné v chladničce. Přidá se těsně před nalitím lepidla.
· polyakrylamidová elektroforéza: použité sklo při elektroforéze by mělo být před a po každé elektroforéze omyto. Po elektroforéze omyjte měkkým kartáčem a hadříkem v horké mýdlové vodě, opláchněte destilovanou vodou a nechte uschnout.
· Vlhkost a prach mohou způsobit podráždění dutého polymeru. Před elektroforézou očistěte skleněnou destičku čističem skla a otřete ji měkkým kartáčem. Omyjte destilovanou vodou a důkladně osušte papírovým ubrouskem. Opláchnutí 70% ethanolem před otřením papírem pomáhá vyčistit a urychlit schnutí. Postupně přidávejte vzorky akrylamidu: BIS, vodu, pufrovací roztok, persíran amonný, TEMED. Dobře protřepejte a ihned nalijte.
Před polymerací není nutné polyakrylamid odplyňovat. (Akrylamid se dříve umisťoval do vakua, aby se odstranily bubliny, protože kyslík polymeraci inhibuje.)
Vzorky hrotů pro horizontální lepení.
· Vložte do spodní krabice kus černého papíru s černým pozadím, abyste vytvořili otvor pro vzorek, aby byl vzorek lépe viditelný.
· pufr naplněný nádržkou na lepidlo, těsně nad koloidem.
· pokud je na okraji světlo, zapněte světla a nechte koloidní světlo svítit. Natáhněte vzorek do pipety.
· pomocí automatického pipetovacího zařízení.
· v 10-200 mu lze ve většině bodů vzorku použít 1 pohyblivý bod kapaliny. Pro velmi malé otvory ve vzorku (méně než 10 μ1) je pohodlnější dlouhá pipetovací hlavice používaná pro sekvenování lepidla.
· pipetování pouze ponořené do vzorku, vdechování pomalu se pohybující tekutiny. Vzorek se může jevit lepkavý od glycerinu a rychlé pumpování může vtáhnout vzduchové bubliny do hlavice pipety.
· Po vdechnutí vzorků pipetovací hlavicí jemně posuňte hlavičku s tekutinou po okraji trubice nebo utíracím papírem a odsajte hlavičku s tekutinou mimo kapičky. Dávejte pozor, abyste vzorek nevsáli.
Vložte vzorek do otvoru pro vzorek
· pipetovací zařízení pro udržení mírného tlaku, aby vzorky mírně pohnuly přepadovou kapalinovou hlavou.
· Pipetovací hlavice zasunutá do pufru, mírně výše než otvory pro měření bodu, udržuje přetlak. Špičku pipety lze zasunout do malého otvoru.
· Pomalu a plynule vyjímejte vzorky. Špička pipety se umístí nad bodový otvor pro vzorek a vzorek se do otvoru ponoří. Nechte vzorek klesnout, aby se otvor zaplnil, místo abyste ho zatlačili dovnitř.
· jakmile poslední kapka vzorku klesne na hlavu kapaliny, kapalina se přesune do druhé nohy, pomalu se zvedne a vyjde z pufru
Jak provést vertikální odběr vzorků lepidla?
· vertikální otvory pro vzorek vytvořené mezi dvěma kusy skla. U velmi řídkého lepidla nelze hlavici pipety ani zasunout mezi dvě skleněné destičky. Pozor na glycerin! Nasaďte hlavici pipety nad otvor pro vzorek a vzorek se do otvoru ponoří.
· Před odběrem vzorku se ujistěte, že je svislý bod z polypropylenového acylgelu ve vzorku opláchnut dočista. Smyjte nezpolymerizovaný akrylamid a vodu, která se může objevit na dně vzorku. Voda může výrazně zmenšit vzorkovací otvor. Použijte stříkačku o objemu 25 ml nebo 50 ml a jehlu o průměru 18 G. Nalijte elektroforetický pufr a opatrně propláchněte vzorkovací otvor.
· Může být obtížné vidět otvor pro vzorek, ale zároveň je zbytek snadný. Pokud jsou otvory nadbytečné, lze pufr pro vzorek otestovat bromfenolovou modří.
Čas zveřejnění: 31. března 2023